□ 陶文靖

    自然界中广泛存在着各种微生物,这些微生物在食品生产各个环节中都可能会对食品造成污染。陶老师是微生物控制领域具有深厚影响力的学者,为了更加深入的了解微生物快速检测方法,陶老师整理了关于食品中的微生物快速检测的一些问题,并就这些问题一一作出了解答。
1 如何定义食品中微生物快速检测方法?
    食品快速检测的广泛定义是简单、快速、准确的分析方法,能够对处理好的样品在很短的时间内检测出结果。如今,大部分理化项目快速检测方法可以实现在几小时甚至几分钟内检测出结果。
快速检测方法具有如下一个或者几个特点:
   (1)检测时间比标准方法短;
   (2)操作简单,流程简单,判断明确;
   (3)灵敏度高,结果准确;
   (4)实现自动化。
    但是,对于食品中微生物检测而言,必须经历培养、增菌等阶段,无法实现在1~2个小时内出结果。
2 食品中微生物快速检测方法具备的特点?
    食品中微生物快速检测方法具有如下一个或者几个特点:
   (1)操作简便,检测速度快,检测时间短;
   (2)灵敏度高、特异性强,检测结果更为精确;
   (3)自动化程度高,减少人为参与,降低人工成本;
   (4)对检验人员经验依赖程度低,操作简单,易于标准化;
   (5)产品更小、更轻、更便携,更适合现场检测。
3 目前常用的食品微生物快速检测方法有哪些?
     常用的食品微生物快速检测技术从大类上主要有:传统计数改良方法,免疫学方法,分子生物学方法。
   (1)传统计数改良方法是在传统培养方法基础上进行改良的计数方法,克服传统方法培养时间长、操作繁琐、误差大等缺点,包括培养基改良法、滤膜法、纸片法。
   (2)免疫方法是以抗原抗体的特异反应为基础,利用不同微生物特异抗原激发机体产生特异抗体,从其特异性检测相应的致病微生物。常用的免疫学方法有酶联免疫吸附技术、免疫胶体金技术、上转发光技术、免疫磁珠分离技术和乳胶凝集法等。
   (3)分子生物学方法,其中PCR技术是应用最广的分子生物学方法,主要应用为普通PCR,荧光定量PCR和等温扩增等。
    除以上常见快检方法外,近些年发展的飞行时间质谱、微流控技术、流式细胞技术、新一代测序技术等新兴技术也正在或将要应用于食源性致病微生物的快速检测。
4 几种食品微生物快速检测方法的差异主要有哪些?
    改良的计数方法,克服传统方法培养时间长、操作繁琐、误差大等缺点,操作接近国标方法,目前使用最广泛,可定量,可定性。免疫学方法优势是特异性高,操作时间短、检测结果可靠,适合批量检测和自动化检测(VIDAS),劣势是高质量抗体获得困难、产品开发周期长、检测灵敏度受靶标蛋白的影响大。分子学方法优势是靶标明确,操作时间短、检测结果可靠,但核酸提取效率和系统稳定性是一大挑战。
5 如何评价一个食品微生物快速检测体系?
    食品中的微生物尤其是致病菌具有检出率高但是含量低的特点,故检测方法的灵敏度和限量要求之间有着很大的差异。因此,一个好的检测系统应该包括一个好的增菌培养方法和一个好的检测方法,二者要综合起来一起评价。一个好的增菌培养方法要满足以下条件:微生物的复苏能力要强,生长速度要快,选择性要好,产量要高;而一个好的检测方法需要具备速度快、准确度高,结果准确明晰等特点。
6 目前有国家标准的食品微生物快速检测方法有哪些?
    从GB 4789中可以看出,显色培养基、微生物鉴定系统已被广泛应用,沙门氏菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌可采用全自动微生物检测鉴定系统,除此之外,还有以下方法也被国标应用:
   (1)GB 4789.6-2016食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验中提到,取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行PCR确认试验。
   (2)GB 4789.10-2016食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验中关于金葡肠毒素检测,可用A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型酶联免疫吸附试剂盒完成。
   (3)GB 4789.12-2016食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验毒素基因检测采用PCR进行扩增和检测。
   (4)GB 4789.36-2016食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验,可用免疫磁珠捕获法检测,此外,毒力基因检测采用PCR进行扩增和检测。
   (5)GB 4789.42-2016食品微生物学检验诺如病毒检验采用实时荧光RT-PCR方法进行检测。
   (6)GB 14934-2016食品安全国家标准消毒餐(饮)具可采用餐具大肠菌群纸片法进行检测。
7 国外微生物快速检测方法的应用情况如何?
    目前,就技术应用而言,欧盟使用传统方法和快速方法的比例各占50%;美国主要以快速方法(包括基于免疫学技术的侧向层析试纸和ELISA试剂盒)和分子生物学方法(如PCR)为主,我国仍沿用传统培养方法,这已经难以满足食品安全监管及企业/行业对检验时效性的需求。
8 目前大部分快速检测方法没有标准,企业可以用吗?
    国家标准方法是不可替代的,在产品出厂检测、政府执法、第三方出具报告等方面必须采用国家标准方法进行检测。目前微生物的国标检测方法普遍为培养法,因此在谈到微生物检测的国标时,通常指的是培养法,但是随着技术的进步,越来越多的新技术及其方法将进入国家标准。
    在企业质量内控,如:原辅料检测、生产环境监测、过程产品监测等欢迎都可以采用快速检测方法,但前提是,所选的方法/产品,实验室必须要跟国标进行比对,对准确性和稳定性就行测试后方可采用。
9 企业如何选择适合自己的微生物快速检测方法?
    没有最好的方法,只有最适合的方法,企业在选择快速检测方法时要从产品、检测项目、检测量、预算等多个方面进行考虑。选择快速检测产品时,要从产品的准确度、稳定性、操作便捷、成本等方面考虑。
   (1)检测样品决定选用方法。检测方法均具有一定的适用范围,例如,诺如病毒的ELISA试剂盒适用范围为粪便,如果制定为检测蔬菜的行标就不合适;在沙门氏菌检验中低菌量样品可以一步增菌。
   (2)检测项目决定选用方法。例如:定量检测的项目,采用测试片、显色培养基等方面;致泻性大肠杆菌,采用PCR方法检验;金葡肠毒素,采用免疫方法检测。
   (3)样品数量。样品数量大、建议采用免疫学方法,例如ELISA。
   (4)实验室预算。预算少,可以采用不需要仪器纸片法、免疫学方法,预算多,可选用全自动微生物检测鉴定仪、PCR等。
10 企业如何通过实验判定某个微生物快速检测产品是否符合需求?
    首先,判定标准要从准确度、稳定性、操作是否方便等方面进行测试。其次,实验又分定量实验和定性试验两种。定量实验,跟国标方法比对准确率和使用便捷性,设计标准菌实验和样品实验,进行计数比对,交叉反应比对,判定生长率、特异性及稳定性。定性试验,主要是致病菌检测,比度假阳性/阴性率及使用便捷性,设计标准菌实验和样品添加实验,来判断产品的稳定性和准确性。此外,从验证频率上,建议每半年进行一次比对验证,确定产品的稳定性;同时,建议同类产品选择两个以上品牌产品进行使用。
11 荧光定量PCR、等温PCR、普通PCR的区别?
    实时荧光RT-PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程,并对起始模板进行定量分析的方法。普通PCR是借助DNA电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析。等温PCR又称环介导等温扩增技术能在等温(60~65℃)条件下,短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增,是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法(具体区别见表1)。